Просто о сложном: crispr/cas

Исследования идут. Но не по струнке

О лечении людей с помощью технологии CRISPR/Cas9 говорить еще рано. Эффективность этой технологии пока слишком мала, вместе с нужным разрезом в геном часто вносят лишние, случайные. Действительная эффективность в немалой степени зависит от типа клеток, подвергающихся редактированию, от их природы: то, что хорошо срабатывает на лабораторных мышках, может не так работать на людях. Метод новый, и прежде всего его нужно изучать, причем на человеческих эмбрионах и яйцеклетках. Работы в этом направлении ведутся, но спотыкаются об этические принципы проведения исследований. Как, например, эксперименты по редактированию генома эмбрионов человека, которые проводили китайские ученые примерно год назад.

В начале февраля появилось сообщение, что Великобритания разрешит редактирование генома эмбрионов человека в исследовательских целях. Пока это разрешение будет дано только одной группе ученых и с весьма строгими ограничениями: эмбрионы с отредактированным геномом нужно будет уничтожить в течение 2 недель после их получения, и уж конечно, их нельзя будет имплантировать женщине для вынашивания. Впрочем, раньше такие исследования были запрещены вообще во всех странах Запада, поэтому прогресс налицо.

Это разрешение и будущие исследования – серьезный шаг к тому, чтобы начать применять технологии редактирования генома на людях. В будущем CRISPR/Cas9 может изменить подход к лечению. При многих наследственных болезнях, которые раньше невозможно было вылечить, или при которых была доступна только симптоматическая терапия, можно будет устранить саму причину болезни. В первую очередь речь идет о генетических заболеваниях, в которых «виновен» один ген, таких как муковисцидоз, гемофилия, бета-талассемия.

Выразите Свою Реакцию

Минимальное редактирование

Про классический CRISPR-Cas теперь всё знают даже небиологи. Тот, кто хочет отредактировать определенный участок ДНК, синтезирует комплементарную ему гидРНК. ГидРНК закрепляет на этом участке фермент нуклеазу, разрезающий ДНК, чаще всего Cas9. После разрезания ДНК склеивают, вставляя правильный участок вместо вырезанного, собственные механизмы репарации клетки. Проблема в том, что эффективность работы этой системы пока далека от стопроцентной, и это сильно ограничивает медицинские применения, например исправление вредных мутаций. Выводить из строя гены с помощью CRISPR получается хорошо, и это очень радует экспериментаторов, но хотелось бы двигаться дальше.

В октябре 2017 года практически одновременно были опубликованы онлайн две статьи в Science и Nature — о двух новых модификациях метода CRISPR-Cas9. Первая предназначена для редактирования ДНК (Nature, 2017, V. 551, p. 464–471), вторая — РНК (Science, 2017, eaaq0180). В отличие от классического метода, они не предполагают разрезания нуклеиновой кислоты, не расщепляют дезоксирибофосфатную цепь (или рибозофосфатную, в случае РНК), а исправляют азотистое основание. Одна буква генетического кода превращается в другую, не покидая своего места.

Руководитель первой работы — Дэвид Лю из Гарвардского университета (и он, и его соавторы аффилированы также в Институте Брода; этот институт, занимающийся биомедицинскими и генетическими исследованиями, связывают партнерские отношения с Гарвардом и Массачусетским технологическим институтом). Они использовали «мертвую» (dead) Cas9, или dCas9, которая не разрезает обе ее нити, как обычная, но точно так же садится на определенный участок. Модификацию вносит другой фермент — он превращает азотистое основание аденин (А) в инозин I. Буквы I в ДНК нет, и клеточные механизмы репарации либо копирования ДНК переправляют I на G — гуанин. В итоге пара нуклеотидов А–Т заменяется на G–C.

Буквы в ДНК корректировали и раньше: в 2016 году Лю с соавторами опубликовал статью об инструменте для замены цитозина С на тимин Т (то есть пары С–G на Т–А)

То и другое важно: причина многих наследственных заболеваний — как раз однонуклеотидные замены в геноме. Конечно, не всех, но путь в тысячу ли начинается с одного шага

«Было бы и недальновидно с научной точки зрения, и стратегически некорректно делать вывод, что редактирование оснований может стать лучшим способом генной терапии человека, — отмечает Лю. — Уже ясно, однако, что теперь в игре мощная альтернатива стандартному CRISPR».

А Фэн Чжан с соавторами создали орудие для редактирования РНК. Принцип тот же, «мертвая» нуклеаза другая — dCas13, в РНК также исправляется A на I, но, поскольку при синтезе белка на матрице РНК инозин считывается как гуанин, дальше можно ничего не менять. Свою систему авторы назвали RNA Editing for Programmable A to I Replacement (REPAIR). Они предполагают, что редактирование короткоживущих молекул матричных и регуляторных РНК может быть более безопасным терапевтическим методом, чем редактирование ДНК. И, судя по презентациям на сайте, недавно основанная компания Beam Therapeutics, среди соучредителей которой Дэвид Лю и Фэн Чжан, делает ставку именно на редактирование единичных нуклеотидов.

Заметим, что лаборатория Дудны также занимается редактированием азотистых оснований.

Новое лечение рака и заболеваний крови

Внедрение CRISPR прямо в человека довольно рискованно, поэтому сейчас исследователи редактируют клетки вне тела, а затем вводят их обратно в пациентов.

В США в скором времени пройдет клиническое исследование, в котором примут участие 18 человек с такими заболеваниями, как множественная миелома, саркома и меланома. Ученые извлекут их иммунные клетки и при помощи CRISPR изменят их так, чтобы они могли атаковать раковые клетки. Отредактированные клетки введут обратно в пациентов.

Другая компания, CRISPR Therapeutics, планирует использовать CRISPR для лечения людей с бета-талассемией и серповидноклеточной анемией. Это два связанных заболевания, вызванных мутациями в одном и том же гене. Эти мутации влияют на способность человека вырабатывать гемоглобин – важнейший элемент крови, железосодержащий белок и основной компонент эритроцитов. Компания заявила, что начала набор пациентов с бета-талассемией для исследования в Германии. В США же пробное лечение больных серповидноклеточной анемией планируется на конец 2018 года.

В ходе исследований ученые будут извлекать стволовые клетки костного мозга пациентов, редактировать их, а затем вводить обратно.

Болезнь Хантингтона

Около 30 000 людей в Соединенных Штатах по данным Общества Болезни Хантингтона Америки страдает от наследственного заболевания называется болезнью Хантингтона. Это фатальное генетическое заболевание, которое заставляет нервы в мозге ухудшаться с течением времени. Симптомы включают изменения личности, колебания настроения, неустойчивую походку и невнятную речь.

Заболевание возникает из-за дефектного гена, который становится больше, чем обычно, и образует более крупную, чем нормальную, форму белка, называемого Гентингтин, который затем разбивается на более мелкие токсичные фрагменты, которые накапливаются в нейронах, нарушая их функции.

Но в июне 2017 года ученые сообщили в Journal of Clinical Investigation, что вылечили заболевание у лабораторных мышей, которые были сконструированы таким образом, чтобы вместо мышиного гена Гентингтин был Гентингтин человека. Су Ян, почетный научный сотрудник отдела генетики человека в Университете Эмори в Атланте и Ренбао Чанг, в Институте генетики и биологии развития Китайской академии наук, использовал CRISPR, чтобы вырезать часть мутантного гена Гентингтин, производящего токсичные частицы.

После того, как они сделали это, количество ядовитых фрагментов уменьшилось в мозгу мышей, и нейроны начали заживать. Поврежденные мыши восстановили некоторый моторный контроль, баланс и силы. Хотя их производительность по определенным задачам была не так хороша, как у здоровых мышей, результаты показали потенциал CRISPR для борьбы с этим заболеванием.

В заявлении ученые подчеркнули, что необходимо провести более строгие исследования, прежде чем можно будет лечить таким образом людей.

Революция в исследовании

Биологи уже долгое время могли редактировать геном при помощи молекулярных инструментов. Примерно десять лет назад они заинтересовались особыми ферментами — нуклеазами «цинковые пальцы», которые обещали редактировать геном аккуратно и эффективно. Но «цинковые пальцы», стоившие $5,000 и больше, были не очень широко распространены из-за своей дороговизны и неудобством в создании – так считает Джеймс Хэйбер (James Haber), молекулярный биолог из Брандейского университета в городе Уолтем, штат Массачусетс. CRISPR работает по-другому: фермент Cas9, используя РНК, манипулирует с целевыми ДНК, расщепляя их или встраивая нужные последовательности в них. Исследователям зачастую нужно заказать только фрагменты РНК; остальные компоненты можно купить самому. Итоговая цена: около $30. «Это сделало технологию гораздо более доступной, потому все её и используют», — делится своими мыслями Хэйбер. «Это  большой прогресс».

Методология CRISPR быстро затмила собой нуклеазы «цинковые пальцы» и другие инструменты по редактированию (см. «Возвышение CRISPR»). Для некоторых это означает отказ от техник, на которые были потрачены годы для их улучшения. «Я подавлен», — говорит Билл Скарнес (Bill Skarnes), генетик из Хинкстона (Великобритания), — «но в то же время взволнован». Скарнес потратил немалую часть своей карьеры, используя технологию, внедрённую в середине 1980-х: встраивание ДНК в эмбриональные стволовые клетки и последующее использование этих клеток для создания генетически модифицированных мышей. Техника стала в лаборатории главенствующей, но она также была трудоемкой и дорогостоящей. CRISPR требует гораздо меньше времени, и, в конце концов, Скарнес принял эту технологию два года назад.

Публикации: Scopus; Patents: The Lens; Funding: NIH RePORTER.

Исследователи традиционно полагались на такие модельные организмы, как мыши и дрозофилы, частично потому что они были одними из немногих видов, которые хорошо подходили к набору инструментов для генетических манипуляций. Сейчас CRISPR делает возможным редактировать гены во многих других организмах. Например, в апреле исследователи Уайтхэдовского института доложили об использовании CRISPR для изучения Candida albicans, гриба, который является особенно смертельным для людей с ослабленной иммунной системой, но с которым было тяжело проводить генетические манипуляции в лаборатории. Дженнифер Доудна (Jennifer Doudna), первопроходец в изучении CRISPR, ведёт список CRISPR-модифицированных существ. На данный момент у неё есть записи о трёх дюжинах, включая вызывающих заболевания паразитов трипаносом и дрожжей, используемых для создания биотоплива.

Тем не менее, быстрый прогресс имеет и свои недостатки. «Люди просто лишены времени оценить некоторые базовые параметры этой системы», — говорит Бо Хуанг (Bo Huang), биофизик Калифорнийского университета. «Существует мнение, что до тех пор, пока это работает, мы не должны понимать, как и почему это работает». Это означает, что исследователи иногда наталкиваются на внезапную «аварию». Хуанг и его лаборатория два месяца боролись за то, чтобы адаптировать CRISPR для изучения изображений.

Он подозревает, что задержка была бы короче, если бы было больше известно о том, как оптимизировать конструкцию направляющих РНК (guide RNA) – базовый, но важный нюанс.

В общем и целом исследователи смотрят на эти пробелы как на небольшую цену за  мощнейшую технологию. Но у Доудны начались более серьёзные беспокойства по поводу безопасности. Её опасения начались на встрече в 2014 г., когда она увидела презентацию работы одного пост-дока, в которой был спроектирован вирус для внесения компонентов CRISPR в мышь. Мышь вдохнула вирус, что позволило системе CRISPR индуцировать мутации и создать модель человеческого рака лёгких. Доудну хватила дрожь; небольшая ошибка в дизайне направляющей РНК могла повлиять на то, что CRISPR-система сработала бы и на человеческих лёгких, причём так же хорошо. «Мне показалось невероятно пугающим, что вы могли иметь студентов, которые работали с подобными вещами», — говорит она

«Очень важно понимать, что эта технология может совершить»

Андре Вентура (Andrea Ventura), онколог из Нью-Йорка и главный автор этой работы говорит, что его лаборатория тщательно рассмотрела вопросы безопасности: направляющие последовательности  спроектированы для нацеливания именно тех областей генома, которые уникальны для мышей, а вирус был ослаблен, благодаря чему не мог реплицироваться

Он согласился, что очень важно предвидеть даже отдалённые риски. «Просто необходимо, чтобы всё было учтено»

Хроническая боль

Хроническая боль не является наследственным генетическим заболеванием, но ученые изучают способы использования CRISPR для предотвращения боли в спине и суставов путем изменения генов для уменьшения воспаления. В нормальных условиях воспаление — это способ тела сообщать иммунной системе о восстановлении ткани. Но хроническое воспаление может делать обратное и повреждать ткань, в конечном итоге вызывая изнурительную боль.

В марте 2017 года группа исследователей, возглавляемая доцентом биоинженерии профессором Робби Боулсом из Университета штата Юта, сообщила, что они использовали CRISPR для предотвращения определенных клеток от продуцирования молекул, которые предназначены для разрушения ткани и приводят к воспалению, вызывающему боль, согласно заявлению из университета.

Например, эту методику можно было бы использовать для задержки дегенерации ткани после операции на спине. Это может ускорить исцеление и уменьшить потребность в дополнительных операциях для исправления повреждения ткани.

Что такое CRISPR и CRISPR-Cas9?

CRISPR (от англ. — clustered regularly interspaced short palindromic repeats, что значит кластеризованные, регулярно распределенные короткие палиндромные повторы) — это специальные области бактериального генома, содержащие фрагменты ДНК паразитов (бактериофагов), которые ранее заражали эту группу бактерий. CRISPR позволяют бактериям обнаруживать и уничтожать чужеродную ДНК, тем самым защищаясь от инфекций. Генетические локусы CRISPR служат источниками криспр-РНК, которые могут узнавать чужеродные последовательности. Эти молекулы формируют комплексы с белками, способными разрезать ДНК, благодаря чему эти последовательности уничтожаются. Наиболее хорошо изученный CRISPR-комплекс включает ДНК-разрезающий белок Cas9.

Ученые изобрели способ модифицировать природный комплекс CRISPR-Cas9 и программировать его на узнавание практически любых желаемых последовательностей ДНК у человека, животных, растений или любых других организмов. После узнавания искомой последовательности CRISPR-редактор может разрезать ее или, в случае дополнительных модификаций системы, изменить активность близлежащих генов, повлиять на упаковку окружающей ДНК или просто послужить меткой для выбранного участка. Природные и модифицированные CRISPR-эффекторы — это точные, настраиваемые и простые в использовании инструменты, дающие огромные возможности для фундаментальных исследований, лечения генетических заболеваний, создания новых организмов с заданными свойствами, борьбы с вредителями.

История открытия и принцип работы

Среди всех заболеваний одна из самых проблематичных групп — наследственные болезни. Попытки и подходы к лечению генетических дефектов предпринимались раньше, но без особого успеха. Среди наследственных болезней есть группа генных заболеваний. Их причина кроется очень глубоко — на уровне генетического кода человека. Классический пример — гемофилия у последнего царевича Алексея Романова, которая передалась ему от бабушки. В ходе мутации была затронута не ядерная структура ДНК (такое бывает, например, при муковисцидозе), а хромосома, но суть остается прежней — такие болезни считались неизлечимыми.

Вариант тут только один — исправить генетическую структуру человека вручную. Но как? На помощь пришли бактерии.

Все началось в конце 80-х, когда японские ученые секвенсировали  геном кишечной палочки. Их заинтересовал участок, в котором был набор повторяющихся последовательностей ДНК, разделенных различными участками-спейсерами. Специалистов привлек тот факт, что этот участок не кодировал ровным счетом ничего.

В 1960-х для тех последовательностей ДНК, которые не кодируют белков, ввели обидное, а как оказалось, и далеко не точное название — «мусорная ДНК». Дело в том, что большое количество локусов  в геноме неизбежно ведёт к снижению приспособленности, а следовательно — к вымиранию. Японский ученый Сусуму Оно даже назвал точный предел объема генома для млекопитающих — 30000 локусов, и был прав: у человека, например, их всего 20000.

Все сказанное выше справедливо и для бактерий: лишние участки ДНК, которые ничего не кодируют, не нужны, как считалось раньше. А бактерии, в силу, в принципе, небольшого генома, относятся к своим локусам особо экономно. Значит последовательность зачем-то нужна бактерии?

Схема работы системы CRISPR-Cas II типа

Потом такие повторяющиеся цепочки кассет и спейсеров нашли у других бактерий, и стало понятно, что тут точно действует какой-то механизм, а не случайная мутация. Название CRISPR — «короткие палиндромные кластерные повторы» — точно описывает суть явления. Они и правда короткие: те участки, которые разделены спейсерами, повторяются, а по своей структуре эти «повторы» симметричны — читаются одинаково в обе стороны. В русском языке предложения типа «А роза упала на лапу Азора» читаются одинаково в обе стороны и называются палиндромами, вот и генетика решила позаимствовать этот термин.

История

Ранние исследования Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster продемонстрировали крупномасштабные скрининги систематической потери функции (LOF), выполняемые посредством мутагенеза насыщения , демонстрируя потенциал этого подхода для характеристики генетических путей и идентификации генов с уникальными и важными функциями. Техника насыщающего мутагенеза позже была применена к другим организмам, например к рыбкам данио и мышам.

Целевые подходы к нокдауну генов появились в 1980-х годах с такими методами, как , и антисмысловые технологии .

К 2000 году технология РНК-интерференции (РНКи) превратилась в быстрый, простой и недорогой метод направленного нокдауна гена , который обычно использовался для изучения функции генов in vivo у C. elegans . Действительно, всего через несколько лет после открытия Файером и др . (1998), почти все из 19 000 генов C. elegans были проанализированы с помощью .

Производство библиотек РНКи облегчило применение этой технологии в масштабе всего генома, и методы, основанные на РНКи, стали преобладающим подходом для скринингового нокдауна в масштабе всего генома.

Тем не менее, подходы к нокдаун-скринам на основе РНКи имеют свои ограничения. Во-первых, сильные отклонения от цели вызывают проблемы с ложноположительными наблюдениями. Кроме того, поскольку РНКи снижает экспрессию генов на посттранскрипционном уровне за счет нацеливания на РНК, скрининг на основе РНКи приводит только к частичному и краткосрочному подавлению генов. В то время как частичное нокдаун может быть желательным в определенных ситуациях, требовалась технология с улучшенной эффективностью прицеливания и меньшим количеством попаданий вне цели.

С момента первоначальной идентификации как прокариотическая адаптивная иммунная система, система бактерий типа II, сгруппированных с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов (CRISPR) / Cas9 , стала простым и эффективным инструментом для генерации целевых мутаций LOF. Он был успешно применен для редактирования геномов человека и начал вытеснять РНКи как доминирующий инструмент в исследованиях на млекопитающих. В контексте нокаут-скринингов по всему геному недавние исследования продемонстрировали, что экраны CRISPR / Cas9 способны достигать высокоэффективного и полного истощения белка и преодолевать нецелевые проблемы, наблюдаемые при скринингах RNAi. Таким образом, недавнее появление CRISPR-Cas9 резко увеличило наши возможности по выполнению крупномасштабных экранов LOF. Универсальность и программируемость Cas9 в сочетании с низким уровнем шума, высокой эффективностью выбивания и минимальными эффектами вне цели сделали CRISPR платформой выбора для многих исследователей, занимающихся таргетингом и редактированием генов.

Приложения

Система активации dCas9 позволяет экспрессировать желаемый ген или несколько генов в одной и той же клетке. Можно изучать гены, участвующие в определенном процессе, используя широкий геномный скрининг, который включает активацию экспрессии генов. Изучение того, какие sgRNA дают фенотип, позволяет предположить, какие гены участвуют в конкретном пути. Систему активации dCas9 можно использовать для точного контроля того, какие клетки активируются и в какое время происходит активация. Созданы конструкции dCas9, которые включают слитый белок dCas9-активатор в присутствии света или химических веществ. Клетки также можно перепрограммировать или дифференцировать из одного типа клеток в другой путем увеличения экспрессии определенных генов, важных для образования или поддержания определенного типа клеток.

Большой контроль над экспрессией генов

Одна исследовательская группа использовала систему, в которой dCas9 был слит с конкретным доменом C1B1. Когда на ячейку светит синий свет, домен Cry2 связывается с C1B1. Домен Cry2 слит с активатором транскрипции , поэтому синий свет направляет активатор на место, где связан dCas9. Использование света позволяет в значительной степени контролировать активацию целевого гена. Удаление света из клетки приводит к тому, что в гене-мишени остается только dCas9, поэтому экспрессия не увеличивается. Таким образом, система обратима. Аналогичная система была разработана с использованием химического контроля. В этой системе dCas9 рекрутирует слитый белок MS2, который содержит домен FKBP. В присутствии химического RAP домен FRB, слитый с модифицирующим хроматин комплексом, связывается с FKBP. Каждый раз, когда RAP добавляется к клеткам, специфический комплекс модификатора хроматина может быть нацелен на ген. Это позволяет ученым изучить, как конкретные модификации хроматина влияют на экспрессию гена. Система dCAs9-VPR используется в качестве активатора, направляя ее на промотор гена выше кодирующей области. В исследовании использовались различные sgRNA для нацеливания на разные части гена, и было обнаружено, что активатор dCas9-VPR может действовать как активатор или репрессор, в зависимости от места, где он связывается. В клетке sgRNA, нацеленные на промотор, могут позволить dCas9-VPR увеличивать экспрессию, тогда как sgRNA, нацеленные на кодирующую область гена, приводят к снижению экспрессии dCas9-VPR.

Активация по всему геному

Универсальность sgRNA позволяет активаторам dCas9 увеличивать экспрессию любого гена в геноме организма. Это можно использовать для увеличения экспрессии гена, кодирующего белок, или транскрибируемой РНК. В документе показано, что активация на уровне всего генома может использоваться для определения того, какие белки участвуют в опосредованной устойчивости к определенному лекарству. В другой статье использовалась активация длинных некодирующих РНК по всему геному и было обнаружено, что увеличение экспрессии некоторых длинных некодирующих РНК придает устойчивость к лекарству вемурафениб. В обоих случаях клетки, которые выживают при приеме препарата, могут быть изучены, чтобы определить, какие sgRNA они содержат. Это позволяет исследователям определить, какой ген был активирован в каждой выжившей клетке, что позволяет предположить, какие гены важны для устойчивости к этому препарату.

Использование в организмах

Слияние dCas9 с VP64, p65 и HSF1 (фактор теплового шока 1) позволило исследователям нацелить гены Arabidopsis thaliana и повысить транскрипцию до уровня, аналогичного тому, когда сам ген вставлен в геном растения. Для одного из двух протестированных генов активатор dCas9 изменяет количество и размер листьев и позволяет растениям лучше справляться с засухой. Авт. Заключают, что активатор dCas9 может создавать фенотипы в растениях, подобные тем, которые наблюдаются, когда трансген вставлен для сверхэкспрессии. Исследователи использовали несколько направляющих РНК для нацеливания системы активации dCas9 на несколько генов в конкретной линии мышей, в которых dCas9 может быть включен в определенных клеточных линиях с использованием системы рекомбиназы Cre . Ученые использовали адресно и повышенную экспрессию нескольких генов , чтобы исследовать процессы , связанные с регенерацией и карцином в печени .

Превращение свиней в доноров органов

На протяжении десятилетий ученые обсуждали спорную идею о том, что животные могут быть донорами органов. Предыдущие попытки трансплантировать животные органы в человека заканчивались неудачей – иммунная система человека отвергала чужеродные ткани. (Первая трансплантация сердца прошла в 1964 году, ученые пытались пересадить сердце шимпанзе. Пациент умер через два часа). Еще одно препятствие – вероятность попадания инфекций.

Исследователи считают, что CRISPR может решить две эти проблемы.

Компания eGenesis при помощи CRISPR хочет сделать свиней подходящими донорами для людей. Многие свиные органы, например, сердце и почки, похожи на человеческие по размеру. Исследователи использовали технологию для устранения семьи вирусов, обнаруженных в ДНК свиньи, которые могли бы передаться человеку во время трансплантации. Эти вирусы, известные как эндогенные ретровирусы, могут перепрыгивать из клеток свиней в клетки человека и случайным образом интегрироваться в человеческий геном. На данный момент компания произвела десятки безвирусных свиней.

При помощи технологии организация также модифицирует гены, вовлеченные в иммунную систему, чтобы предотвратить вероятность отвержения органов. Тем не менее, пересадка органов генномодифицированной свиньи, скорее всего, пройдет еще нескоро.

Фото: PopMech

Бактериальный иммунитет и йогурт

Итак, у нас были бактерии с CRISPR и не было понимания, для чего он нужен. Тем не менее информация о повторяющихся некодирующих участках копилась, и по их виду даже начали классифицировать микроорганизмы. Это стало удобным способом для защиты авторских прав на бактерии в кисломолочной промышленности: компания Danisco с помощью типирования своих штаммов по виду их CRISPR легко смогла выигрывать суды у тех, кто пользовался их патентами. Сами не зная того, Danisco внесли вклад в борьбу с болезнями, на след которых мы могли не напасть еще долго.

Danisco — датская пищевая компания, которая, помимо всего прочего, занимается производством пищевых заквасок. У компании внушительный пакет патентов — около 9300 штук.

У Danisco была вполне практическая цель — заполучить бактерии, устойчивые к вирусам. Дело в том, что ферментация в промышленных масштабах происходит в огромных чанах с молоком, куда добавляют молочнокислые бактерии. Но если в ферментер попадет вирус-бактериофаг, то ферментация нарушится, и будут убытки. Нужны устойчивые образцы. Как их заполучить? А просто: отобрать в лабораторных условиях такие бактерии, которые могут расти в присутствии вируса.

Danisco выращивала вирусостойкие бактерии и раньше, но до прорыва оставался один шаг. Случился он, когда специалисты обнаружили, что у устойчивых бактерий в последовательности CRISPR появились спейсеры, которые идентичны геному вируса. Последовал эксперимент, и организмам в CRISPR вживили кассеты генома вируса. В результате чего бактерии стали вирусостойкими. CRISPR освободился от звания «мусорной ДНК» — его истинная суть состояла в том, чтобы копировать участки вируса, выполняя роль иммунной системы.

Мышечная дистрофия Дюшенна

Мышечная дистрофия Дюшенна является изнурительным заболеванием, которое развивается из-за мутации в одном гене, называемом геном дистрофина, который является одним из самых длинных генов в организме. Команда исследователей из Юго-западного медицинского центра Университета Техаса во главе с профессором молекулярной биологии Эриком Олсоном работает с CRISPR, чтобы найти способы борьбы с мышечной дистрофией Дюшенна.

Из-за мутации в гене дистрофина организм не создает функциональную форму белка дистрофина, который необходим для здоровья мышечных волокон. Со временем недостаток этого белка вызывает прогрессирующее дегенерацию мышц и слабость.

В апреле 2017 года Олсон и его команда сообщили в журнале Science Advances, что они использовали вариацию инструмента CRISPR под названием CRISPR-Cpf1, чтобы исправить мутацию, которая вызывает мышечную дистрофию Дюшенна. Они фиксировали ген в клетках человека, растущих в лабораторных блюдах, и у мышей, несущих дефектный ген.

CRISPR-Cpf1 — еще один инструмент в инструментальной панели для редактирования генов. Он отличается от более часто используемого CRISPR-Cas9 тем, что он меньше, что облегчает доставку в мышечные клетки, говорится в заявлении юго-западного медицинского центра UT. Он также распознает различную последовательность ДНК, чем Cas9, которая пригодится для редактирования очень длинного гена дистрофина.

Cas9: ДНК-скальпель

Кристаллическая структура Cas9 в комплексе с сгРНК и её целевой ДНК

Еще до изысканий Danisco о защитных свойствах CRISPR говорил биоинформатик Евгений Кунин, который предложил детальную модель работы иммунной системы бактерий. По его мнению, бактерия, пережившая атаку вируса, копировала часть его генома, записывая новые блоки в последовательность CRISPR

Кунин обратил внимание на то, что рядом с CRISPR-кассетами часто располагается белок Cas. Он предположил, что Cas обнаруживает вирус по РНК-копии, синтезированной с CRISPR, а когда обнаруживает, то расщепляет его

Говоря проще, Cas — полицейский, CRISPR — база данных, РНК-копия — фоторобот или ориентировка, а вирус — преступник-рецидивист, который решил повторить своё злодеяние. Своё исследование Кунин опубликовал в ряде научных журналов, но фурора не вызвал. Теперь, после исследования Danisco и исследований, параллельных ему, был собран реальный фактический материал, и научное сообщество зашевелилось.

Еще один шаг в нужную сторону сделала Эммануэль Шарпентье, которая нашла тот самый девятый Cas. В прочих системах CRISPR, которые кодируют белки Cas, действовала целая система, если хотите — отдел полиции. Один белок обнаруживает вирус, другой синтезирует РНК, третий кусает. А Шарпентье нашла такой участок, который кодирует всего один белок, и он делает все сам. И если прочие системы были отделами полиции, то Cas9 — Раст Коул, который борет злодея в одиночку, да простит меня персонаж Вуди Харрельсона.

Дальше — больше, и специалистами была предложена схема, при которой РНК CRISPR кодируется не природными кассетами, которые содержит геном бактерии, а с помощью управляемой человеком ферментации. То есть белок Cas9 уже работал не по наводке природной РНК, а по той схеме, которую выбирал человек. И если запрограммировать CRISPR так, как надо нам, он в теории может разрезать мутировавший ген, отвечающий за болезнь.

Комплекс CRISPR/Cas9

От теоретических выкладок и экспериментов пищевых компаний CRISPR/Cas9 прошел путь до одной из самых востребованных технологий в генной терапии. Но основная битва у нас еще впереди. Технологии предстоит обрасти деталями и научиться сверхточному действию, прежде чем мы сможем победить генетические заболевания.

В идеале все выглядит так: больному, скажем, гемофилией, вводят бактерии с CRISPR, кодированным правильным образом. Cas9, пользуясь синтетической РНК, обнаруживает зараженные участки и разрезает их. Затем мы заменяем разрезанные участки на здоровую ДНК. Или она сама восстанавливается, используя схемы из здоровой парной хромосомы.

Механизм избирательной остановки транскрипции с помощью dCas9 путём стерического препятствия

В отдаленном будущем, когда будут прояснены детали всей процедуры, мы сможем лечить таким образом муковисцидоз, гемофилию и еще некоторые подобные заболевания. Для больных лейкемией еще потребуется химиотерапия, чтобы убить зараженные клетки, но в целом все относительно просто с такими болезнями, у которых есть четкая зависимость от конкретных участков ДНК.

Сложность возникает с заболеваниями, к которым пока не могут найти четких участков генома. В их числе алкоголизм и шизофрения: у них есть явная генетическая база, но исследования постоянно опровергают друг друга, предлагая разные участки генома в качестве ответственного за недуг. У таких болезней непонятно, что нужно резать и как кодировать CRISPR.

Практического применения у технологии пока немного — нужно тщательно изучить детали, обезопасить пациента и повысить эффективность. Но есть и хорошие новости: например, в Китае с помощью CRISPR/Cas9 вылечили около 10% эмбрионов с болезнью крови бета-талассемией. Кстати, болезни крови — первая мишень для CRISPR/Cas9, в них достаточно исправить генетический дефект кроветворной системы. А с этим вполне можно справиться.

Предотвращение слепоты

Согласно данным Национального института здоровья, одной из наиболее распространенных причин детской слепоты является состояние, называемое врожденным амаврозом Лебера, которое поражает примерно 2-3 ребенка на 100 000 новорожденных. Болезнь наследуется и вызвана мутациями по меньшей мере в 14 генах, отвечающими за нормальное зрение.

Кембриджская биотехнологическая компания Editas работает над терапией на основе CRISPR, чтобы отменить тип болезни, названной врожденным амаврозом типа 10. Компания стремится подать необходимые документы в Управление по контролю за продуктами и лекарствами до конца 2017, чтобы начать первые испытания на людях в отношении лечения этого состояния, сообщает информационный сайт биотехнологий Xconomy.

Editas был учреждена Фэн Чжаном, профессором биоинженерии в Массачусетском технологическом институте, который продемонстрировал, что CRISPR-Cas9 можно использовать для клеток человека. Дженнифер Дудна из Unversity of California, Berkeley и Emmanuelle Charpentier, затем Венского университета, также продемонстрировала, что CRISPR-Cas9 может отрезать ДНК, и они подали патент на технологию в 2012 году. Broad Institute, который является частью  Массачусетского технологического института, представила свой патент в апреле 2014 года. Беркли подал иск, согласно которому Дудна был первым, сообщает Nature.

Похожие записи:

Договор хранения товара Обзор сервисов электронного документооборота В реестр отечественного по пустят иностранцев взамен на признание крыма Переезд с http на https: пошаговая инструкция Цели на клик: зачем нужно, как настроить и использовать собранные данные Ваши права на заправке: 5 неочевидных вещей, которые можно сделать бесплатно